一、填料類(lèi)型與應(yīng)用機(jī)理

 

　　多肽純化填料的選擇，主要基于多肽自身的理化性質(zhì)，如疏水性、所帶電荷、分子大小以及特異性相互作用。

 

　　1.反相色譜填料：這是多肽純化，尤其是中小分子量合成多肽常用、有效的手段。其填料基質(zhì)（如硅膠或聚合物微球）鍵合有非極性的官能團(tuán)（C4,C8,C18）。分離機(jī)理基于多肽疏水性的差異，在極性的流動(dòng)相（如水/乙腈、水/甲醇體系）和非極性的固定相之間進(jìn)行分配。通過(guò)梯度增加有機(jī)相比例，疏水性較弱的多肽先被洗脫，疏水性強(qiáng)的后出峰。C18填料適用于小肽，而C4或C8因疏水性較弱，更適合保留和分離分子量較大或疏水性強(qiáng)的多肽，有助于維持其活性。

 

　　2.離子交換色譜填料：該填料利用多肽在特定pH值下所帶凈電荷的差異進(jìn)行分離。分為陽(yáng)離子交換（如磺酸基團(tuán)）和陰離子交換（如季銨基團(tuán)）填料。通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值或離子強(qiáng)度（鹽濃度梯度），帶電性質(zhì)不同的多肽依次被洗脫。此法特別適用于帶有大量正電荷或負(fù)電荷的多肽的粗純和中間純化步驟，且填料壽命長(zhǎng)、成本相對(duì)較低。

 

　　3.疏水相互作用色譜填料：與反相色譜類(lèi)似，HIC也基于疏水作用，但其條件更為溫和。填料表面的疏水基團(tuán)較弱，并在高鹽濃度的水相中吸附多肽，通過(guò)降低鹽濃度進(jìn)行洗脫。這種“鹽析-鹽溶”的過(guò)程能更好地維持多肽的空間構(gòu)象和生物活性，因此是重組蛋白和多肽純化中的重要工具，尤其適用于對(duì)有機(jī)溶劑敏感的多肽。

 

　　4.尺寸排阻色譜填料：該填料的分離機(jī)理是基于多肽流體動(dòng)力學(xué)體積的大小。填料為具有一定孔徑分布的多孔結(jié)構(gòu)，小分子多肽可進(jìn)入大部分孔內(nèi)，路徑長(zhǎng)、保留時(shí)間長(zhǎng)；大分子多肽被排斥在孔外，先被洗脫。SEC主要用于脫鹽、緩沖液交換和最終精純步驟中去除聚集體，不具備高分辨率，但條件極其溫和，不影響多肽活性。

 

　　二、應(yīng)用策略與發(fā)展趨勢(shì)

 

　　在實(shí)際純化工藝開(kāi)發(fā)中，往往需要將多種填料組合使用，形成高效的純化策略。典型的流程可能是：先利用IEX或HIC進(jìn)行捕獲和粗純，去除大部分雜質(zhì)；然后采用分辨率最高的RPLC進(jìn)行精純，獲得高純度的產(chǎn)品；最后通過(guò)SEC進(jìn)行拋光，確保產(chǎn)品的最終形態(tài)符合要求。

 

　　未來(lái)，多肽純化填料的發(fā)展呈現(xiàn)出以下趨勢(shì)：一是高性能化，如開(kāi)發(fā)粒徑更小、分布更窄的超高效液相色譜填料，以提升分離速度和分辨率；二是智能化與功能化，例如出現(xiàn)更多混合模式色譜填料，將兩種以上的作用機(jī)理整合于一體，提供獨(dú)特的分離選擇性；三是面向特定需求，如專(zhuān)門(mén)用于去除特定雜質(zhì)（如內(nèi)毒素）或用于膜蛋白肽純化的特殊填料。此外，為滿足連續(xù)生物制造的需求，填料的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性也將持續(xù)優(yōu)化。